29 | 05 | 2022
Калашникова В.А HELICOBACTER PYLORI у обезьян: диагностика, генетические особенности микроорганизмов и роль в желудочно-кишечной патологии// Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения», 5-6 мая 2010 г

Калашникова В.А HELICOBACTER PYLORI у обезьян: диагностика, генетические особенности микроорганизмов и роль в желудочно-кишечной патологии// Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения», 5-6 мая 2010 г.: Материалы 10-й Восточно-Сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием.-  Абакан Красноярск.- 2010.-С. 45-52.

Калашникова В.А

HELICOBACTER PYLORI У ОБЕЗЬЯН: ДИАГНОСТИКА, ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ И РОЛЬ В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОЙ ПАТОЛОГИИ.

Введение

Среди этиологических факторов заболеваний желудка и двенадцатиперстной кишки инфекция, обусловленная  Helicobacter pylori         (H.pylori), играет одну из ведущих ролей. Микроорганизмы H.pylori считаются наиболее частой причиной хронического гастрита, этиологически связаны с язвенной болезнью, раком и первичной В-клеточной лимфомой желудка. Однако до сих пор неизвестно, что же предопределяет развитие той или иной формы заболевания [1,2,4]. В России, так же, как и в развивающихся странах, инфицированность населения хеликобактером более высока (до 90%), чем в развитых странах, где она не превышает 65% [1,4]. Существуют предположения о ведущем значении в развитии желудочно-кишечных заболеваний внутривидового разнообразия штаммов H.pylori, генетической предрасположенности, характера иммунного ответа, степени обсеменённости этими бактериями слизистой оболочки желудка [1,4]. В последние годы учёные занимаются исследованием факторов вирулентности штаммов H.pylori. Наиболее известные из них – вакуолизирующий цитотоксин (продукт гена vacА) и маркер «островка патогенности» критический иммунодоминантный белок CagA, кодируемый цитотоксин-ассоциированным геном cagA. Вакуолизирующий цитотоксин VacA вызывает повреждения эпителия желудка, а H.pylori, включающие ген vacA, наиболее опасны при развитии заболеваний желудочно-кишечного тракта. H.pylori  с cagA доминируют в этиологии всех форм гастродуоденальных заболеваний и встречаются при них с близкой частотой, несколько чаще при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, а также вызывают развитие MALT'ом у жителей Европы. Важную роль в приспособлении микроба к жизни в кислой среде желудка играет уреаза, образование которой кодирует ген ure. По наличию cagA и vacA штаммы делятся на группы: тип I – CagA+ и VacA+, который включает Ia ( CagA+ и VacA) и Ib (CagA и VacA+ ); тип II - cagA и vacA. Существует связь между типами  H.pylori и их географическим распространением. Штаммы типа I чаще выделяются в Европе, США, Австралии, а типа II распространены в Юго-Восточной Азии [1].

Данных по исследованию H.pylori, выделенных от обезьян, в зарубежной литературе немного. До сих пор неясно, какова же роль H.pylori в организме здоровых иммунокомпрометированных обезьян-носителей и больных животных, поэтому исследование этого патогена остаётся актуальным [5,6,7,8].

Цель работы – исследование макак и павианов, содержащихся в Адлерском питомнике, на присутствие H.pylori и изучение роли данных микроорганизмов в патологии желудочно-кишечного тракта обезьян.

Материалы и методы

На наличие H.pylori исследованы материалы от 338 обезьян рода макаков (макаки резусы, макаки яванские; n=243) и рода павианов (павианы гамадрилы; n=95). У клинически здоровых животных исследовались фекалии (n=260), а у погибших – кусочки желудка (тело, антрум) и двенадцатиперстной кишки размером 1х1см (n=78). До исследования материал хранили при -200С. Исследование проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для постановки ПЦР использовали коммерческие лиофилизированные ПЦР-тест-системы (ООО «Биоком», Москва, Россия) с праймерами к генам уреазы (ure) размером 318 нуклеотидных пар, гену вакуолизирующего цитотоксина (vacA) размером 565 н.п.  и цитотоксин-ассоциированного гена «островка патогенности» cagA размером 682 н.п. Экстракцию и амплификацию ДНК осуществляли по прилагаемой инструкции [3]. Условия ПЦР для генотипирования ure, vacA, cagA: 1) 60 сек 950С, 40 сек 620С, 90 сек 740С (1 цикл); 2) 30 сек 950С, 30 сек 600С, 60 сек 740С (1 цикл); 3) 20 сек 950С, 20 сек 580С, 40 сек 740С (43 цикла); 4) 60 сек 740С (1 цикл).

Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 1,5% агарозном геле с добавлением 5 мкл этидиума бромида в ТВЕ-буфере в градиенте напряжения 200 В в течение 25 минут. Наличие светящейся полосы жёлтого цвета на уровне полосы положительного контрольного образца свидетельствовало о положительной реакции образца на возбудитель.

Результаты и обсуждение

При обследовании 338 обезьян (родов макаков и павианов) H.pylori обнаружены у 70 (20,7%), при этом возбудители выявлены в фекалиях 32 (12,3%) клинически здоровых животных и в патологическом материале 38 погибших (48,7%).

Обнаружение H.pylori и его генотипов вирулентности у клинически здоровых обезьян.


При исследовании фекалий от 260 клинически здоровых макаков ДНК H.pylori верифицирована в 32 образцах (12,3%). У обезьян рода макаков нуклеотидные последовательности исследуемого микроба выявлены в 32 образцах (16,6%), в то время как ни в одной из проб фекалий от клинически здоровых павианов не отмечено наличие ДНК возбудителя.Анализ одновременного присутствия генотипов вирулентности показал, что чаще выявлен ген уреазы (ure) -13,5%, ген вакуолизирующего цитотоксина (vacA) – в 5,9%,  ген «островка патогенности» (cagA) – в 2,1%. В трёх образцах обнаружено одновременное сочетание двух генотипов ure-cagA и ure-vacA, что составляет 1,6%.

Исследование материала от погибших обезьян.

Обследование 78 погибших обезьян (в основном от желудочно-кишечных заболеваний) показало, что нуклеотидные последовательности возбудителей хеликобактериоза  H.pylori в патологическом материале встречались в 4 раза чаще, чем в фекалиях (48,7%). У погибших макаков H.pylori обнаружены в 40%, а у павианов – в 64,3%.  H.pylori выявлены как в желудке, так и в двенадцатиперстной кишке. Выявление ДНК  H.pylori в желудке немного выше, чем в двенадцатиперстной кишке. Так, в желудке возбудители верифицированы в 33 случаях (86,9%), в двенадцатиперстной кишке – в 27 случаях (71,1%). Анализ результатов генотипирования H.pylori, обнаруженных в патологическом материале показал, что в 26,3% в геноме  данных бактерий выявлены только ген ure, в 2,6% - только ген вакуолизирующего цитотоксина (vacA) и в 7,9% - только ген «островка патогенности» (cagA). Исследование одновременного присутствия у H.pylori генотипов ure, vacA, cagA показало, что  ure-положительные образцы в 21,1% имели также ген вакуолизирующего цитотоксина, а ген «островка патогенности» имели 13,2% изучаемых проб. При этом также наблюдалось  сочетание генотипов вирулентности:   vacA-cagA (7,9%), ure-vacA-cagA (5,3%).

Нами проанализировано распределение генотипов вирулентности H.pylori, выявленных у низших обезьян двух родов, наиболее широко представленных в питомнике (рис.1).

Таким образом, наличие генетического материала H.pylori не зависит от рода обезьян. Ген ure обнаружен приблизительно с одинаковой частотой в геноме H.pylori у обезьян обоих родов, в то время, как частоты встречаемости маркера «островка патогенности» и вакуолизирующего цитотоксина несколько различны. Генотип vacA H.pylori присутствовал в 60% образцов патологического материала макаков, у павианов этот генотип встречался практически в 3 раза реже. CagA-положительный генотип в слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки выявлен в 2 раза чаще у павианов (44,5%), чем у макаков.

Разброс в распределение типов H.pylori в фекалиях и слизистых желудка и двенадцатиперстной кишки был довольно большим (табл. 1). Тип I H.pylori (cagA+, vacA+) обнаружен только в желудке (5,3%) и не выявлен в ДПК и фекалиях обезьян. С наибольшей частотой (до 71%) присутствует  H.pylori II типа (cagA-, vacA-). Частота встречаемости H.pylori типа Ib (cagA-, vacA+) в среднем выше, чем Ia (cagA+, vacA-). Таким образом, доминирующим типом  H.pylori, циркулирующим у низших обезьян, является тип II.

Таблица 1.

Типы  H.pylori, обнаруженные в исследованном материале

Исследуемые материалы

Тип I,

кол-во образцов, (%)

тип  Ia,

кол-во образцов, (%)

тип Ib,

кол-во образцов, (%)

Тип II,

кол-во образцов, (%)

Тело желудка

2 (5,3)

3 (7,9)

7 (18,4)

26 (68,4)

Антрум

2 (5,3)

5 (13,2)

4 (10,5)

27 (71)

ДПК

-

3 (7,9)

9 (23,7)

26 (68,4)

Фекалии

-

4 (12,5)

11 (34,4)

17 (53,1)

Следовательно, существенных различий по распределению H.pylori в теле желудка, антруме, двенадцатиперстной кишке нет.

Распределение генотипов вирулентности  H.pylori в желудке и двенадцатиперстной кишке при различных ЖКТ заболеваниях обезьян.

Частота обнаружения  H.pylori и его генотипов вирулентности в сопоставлении с заболеваниями обезьян показывает, что H.pylori выявляются при всех формах желудочно-кишечных заболеваний, а также некишечной нозологии. Тем не менее, при гастроэнтероколитах у обезьян H.pylori обнаружены гораздо чаще (70,6%), чем при других заболеваниях. Однако, исследование отделов алиментарного тракта обезьян, погибших не от желудочно-кишечных заболеваний, показало наличие  H.pylori в 60% (рис 2).

 

Результаты верификации генов вирулентности H.pylori, выявленных при различных заболеваниях у обезьян, представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Частота выявления  генотипов H.pylori в желудке и двенадцатиперстной кишке у погибших обезьян при разных заболеваниях

Заболевание

ure

vacA

cagA

Гастроэнтероколиты; n=17

9 (53%)

2 (11,8%)

5 (29,4%)

Гастриты; n=4

1(25%)

1 (25%)

1 (25%)

Энтероколиты; n=27

5 (18,5%)

7 (25,9%)

3 (11,1%)

Колиты; n=7

3

2

2

Энтериты; n=3

2

-

-

Другая нозология

(пневмония, травмы и т.д.); n=20

7 (35%)

4 (20%)

2 (10%)

Как видно из таблицы, при гастроэнтероколитах ген ure и «островок патогенности» cagA  H.pylori встречаются чаще, чем при других формах желудочно-кишечных заболеваний. Частота обнаружения гена ure колебалась от 18,5% (при энтероколитах) до 53% (при гастроэнтероколитах) у обезьян. При исследовании материала от двух погибших обезьян с диагнозом «энтерит» обнаружены только гены уреазы. Из четырёх обследованных животных с диагнозом «гастрит» H.pylori обнаружены у одной, при этом верифицированы все исследуемые генотипы вирулентности.

Нами зарегистрирован маркер «островка патогенности» H.pylori, который в 10-29,4% присутствовал в материале, взятом практически при всех заболеваниях, кроме энтеритов. Однако у обезьян, погибших не от желудочно-кишечной патологии, обнаружены также  H.pylori, имеющие в своём геноме вышеназванные гены вирулентности. Так, ген ure присутствовал в 7 (35%) образцах, в 4 (20%) - vacA, cagA выявлен в 2 (10%) образцах. Таким образом, частота встречаемости генотипов H.pylori  vacA  и cagA при желудочно-кишечных и некишечных заболеваниях не имеет особой закономерности.  Исходя из данных, представленных в таблице 2, мы предполагаем, что распределение генотипов H.pylori при желудочно-кишечных заболеваниях обезьян имеет скорее всего случайный характер. Несмотря на достаточно высокую частоту выявления ДНК H.pylori, нами не отмечены случаи дуоденальных язв у  обезьян.

Возможно, существует некоторая ассоциация между типами  H.pylori и заболеванием обезьян (табл. 3), поскольку I тип данного возбудителя у клинически здоровых макаков не обнаружен. Тип Ia  H.pylori в 2 раза чаще выявлен у больных павианов, в то время как у макаков (живых и погибших) он присутствовал в 15% случаев. Тип Ib зафиксирован в 31% образцов фекалий и 55% образцов патологического материала у макаков, при этом выявление данного генотипа  H.pylori у павианов составляет 11%. II тип  H.pylori обнаружен у 8 (45%) погибших павианов и 7 (35%) погибших макаков. Этот же тип возбудителя встречался в 47% среди клинически здоровых макаков.

Таблица 3.

Обезьяны, тип

I тип

кол-во образцов,  (%)

Ia тип

кол-во образцов,  (%)

Ib тип

кол-во образцов, (%)

II тип

кол-во образцов,  (%)

Здоровые макаки

-

5 (16%)

10 (31%)

15 (47%)

Погибшие макаки

3 (15%)

3 (15%)

11 (55%)

7 (35%)

Погибшие павианы

2 (11%)

6 (33%)

2 (11%)

8 (46%)

Заключение

Результаты нашего исследования показали, что микроорганизмы рода Helicobacter широко распространены среди обезьян, содержащихся в адлерском питомнике, причём в фекалиях H.pylori встречаются гораздо реже, чем в слизистых желудка и двенадцатиперстной кишки. Инфицированность              H.pylori больных желудочно-кишечными заболеваниями обезьян в 2-3 раза выше, чем клинически здоровых, что в большей степени связано с низким иммунным статусом больных животных. CagA-позитивные  H.pylori верифицированы в 29% случаев у обезьян с гастроэнтероколитами. Так как частота обнаружения  H.pylori и генотипов вирулентности при гастроэнтероколитах достаточна высока, то H.pylori можно считать этиологическим агентом данного заболевания. Не выявлено каких-либо значимых ассоциаций между vacA генотипом и конкретным заболеванием. Несмотря на достаточно высокий процент обнаружения ДНК  H.pylori, не отмечены случаи дуоденальных язв у обезьян. Выявление данных микробов в желудке у обезьян выше, чем в двенадцатиперстной кишке. Установлено, что тип I  H.pylori обнаружен только в желудке погибших обезьян. Тип Ib чаще встречается в двенадцатиперстной кишке и фекалиях. Замечено, что микроорганизмы типа Ia характерны для павианов, а Ib – для макаков. Высока частота распространения  H.pylori II типа. В основном, этот тип микроорганизмов,  циркулирует среди обезьян различных родов. Возможно, это связано с тем, что наши обезьяны африканского и азиатского происхождения, поэтому среди них, как и азиатской популяции людей, доминирует именно II тип  H.pylori.

Таким образом, приведённые выше данные позволяют получить в скором времени ответы на неясные вопросы вирулентности  H.pylori и,  в связи с этим, сравнить влияние механизмов патогенности данных микробов на развитие заболеваний желудочно-кишечного тракта у обезьян и людей. Кроме того, изучение факторов вирулентности  H.pylori также важно для расшифровки механизма развития инфекционного процесса и решения проблемы специфической профилактики заболевания.

Выводы

Исследование проводится при поддержке РФФИ «Кубань-Юг» (грант № 09-04-96522)

Литература.

  1. Домарадский И.В., Исаков В.А. Helicobacter pylori и его роль в патологии.//ЖМЭИ, 2000, № 4, с. 113-117.
  2. Исаева Г.Ш., Поздеев О.К., Челышев Ю.А., Муравьёва Е.В., Виджесингхе Ч.Д. Маркеры вирулентности штаммов Helicobacter pylori, выделенных от больных с  онкологическими и предраковыми заболеваниями желудка.//ЖМЭИ, 2003, № 6, с. 6-11.
  3. Инструкция по применению тест-системы GenePak DNA PCR test для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции.//Biokom, Москва, 2006, 14 с.
  4. Момыналиев К.Т., Смирнова О.В. ,Челышева В.В., Кудрявцева Л.В., Воробьёв А.А., Говорун В.М. Генотипорование клинических изолятов Helicobacter pylori в России.//Вестник Рос. Акад. Мед. Наук, 2003, № 6, с. 33-38.
  5. Doia S.Q., Kimbasona T., Reindelb J., Dubois A. Molecular characterization of Helicobacter pylori strains fron cynomolgus monkeys (M.fascicularis).//Vet.Microbiol., 2005, vol. 108, № 1-2, p. 133-139.
  6. Dubois A., Fiala N., Weichbrod R.H., Ward G.S., Marienix, Menlman P.T., Taub D.M., Perez-Perez G.I., Blaser M.J. Seroepizootiology of Helicobacter pylori Gastric Infection in Nonhuman Primates Housed in Social Environments.//J. of Clinical Microbiology, 1995, vol. 33, № 6, p. 1492-1495.
  7. Fujiyama K., Fujioka T., Murakami K., Wasu M. Effects of Heliocbacter pylori infection on gastric mucosal defense factors in Japanese monkeys.//J. Gastroenterology, 1995, vol. 30, p. 441-446.
  8. Solnick J.V., Chang k., Canfield D.R., Parsonnet J. Natural Acquisition of Helicobacter pylori Infection in Newborn Rhesus Macaques.// J. of Clinical Microbiology, 2003, vol. 41, № 12, p. 5511-5516.