12 | 08 | 2020
Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Чикобава М.Г. Естественное инфицирование низших приматов вирусом гепатита С//Бюл. Экспер. Биол. – 2002. – .Т. 133, № 2. - С. 211-214

Корзая Л.И., Лапин Б.А., Кебурия В.В., Чикобава М.Г. Естественное инфицирование низших приматов вирусом гепатита С//Бюл. Экспер. Биол. – 2002. – .Т. 133, № 2. - С. 211-214.

ЕСТЕСТВЕННОЕ ИНФИЦИРОВАНИЕ  НИЗШИХ  ПРИМАТОВ  ВИРУСОМ  ГЕПАТИТА  С 

Л.И. Корзая, Б.А. Лапин, В.В. Кебурия,  М.Г.Чикобава.

Впервые представлены серологические и вирусологические доказательства  естественного инфицирования низших обезьян Старого Света вирусом гепатита С (ВГС) человека или, возможно, антигенно родственным, но генетически отлич­ным от него штаммом обезьян. Полученные данные могут представлять не только теоретиче­ское, но и большое практическое значение и  послужить базой для дальнейшей разработки экспериментальной модели гепатита С на низших обезьянах.

Ключевые слова: спонтанный  гепатит С,  антитела к ВГС класса G и M,  РНК ВГС, обезьяны

Cчитается, что к вирусу гепатита С человека (как и к другим вирусам, вызываю­щим парентеральные гепатиты) чувствительны только шимпанзе, кото­рые используются в настоящее время для моделирования этой чрезвычайно важной инфекции [2,4]. Однако, в связи с их практической недоступностью  и высокой стоимостью, совершенно очевиден поиск для этих целей других менее дорогостоящих и наиболее доступных видов обезьян. Опубликованные по данной проблеме работы, к сожалению, единичны. В одной из них [3] сооб­щается об отрицательных результа­тах внутривенного заражения ВГС некоторых видов низших обезьян, таких как макаки резусы, макаки яванские,  зеленые мартышки, японские обезьяны и павианs анубисы. В другой работе [7] приводят­ся положительные данные, полученные при эксперимен­таль­ном зара­же­­­нии ВГС маленьких древесных обезьян (tupaias). Что касается исследо­ваний по изучению естественного инфицирования обезьян ВГС, то они практически не проводились. Имеющиеся в литературе серологиче­ские данные об отсутствии антител к вирусу гепатита С (анти-ВГС) у макак резусов и павианов, выполнены на ограничен­ном числе обезьян (по 25 особей каждого вида), что не позволяет  сделать досто­вер­­ные выводы по данному вопросу [6].

Наш институт располагает  уникальной базой низших обезьян Старого Света, представленной различными видами, поэтому было целесообразным, прежде всего, проведение широкого серологического скрининга обезьян на наличие анти-ВГС, а также определение у них вирусологических (РНК ВГС) маркеров спонтанного гепатита С.

МЕТОДИКА  ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследования проводились на базе Адлерского питомника обезьян в 1999-2001 годах. Серологически было обследовано 1398 обезьян различных видов,  содержащихся на разных участках питомника. Среди обслед­ован­ных обезьян были макаки резусы (Macaca mulatta) - 744, макаки яванские (M. fascicularis) - 338,  макаки лапундеры (M. nemestrina)- 63, зеленые мартышки (Cercopithecus aethiops) - 81, павианы гамадрилы (Papio hamadryas) - 138, павианы анубисы (P. anubis) - 34. Кроме того, с целью сравнительного изучения иммуноло­ги­ческого ответа к ВГС у человека, в работе было использовано 26  анти-ВГС позитивных образцов сыво­рот­ки крови: 14 -  от больных с диагнозом  "Вирусный гепатит С" и 12 - от доноров, обследованых на станции переливания крови (г. Сочи).

Анти-ВГС определяли в сыворотках обезьян и человека  с помощью иммунофер­мент­ного анализа (ИФА) с использованием двух коммерческих диаг­ностических тест-систем отечественного производства -  "ГепаСкринтм', ДГУ ЭПП "Вектор-БиАльгам"(Новосибирск) и "ИФА-АНТИ-HCV" "Диагностические системы" (Нижний Новгород).  Положительный результат скрининга анти-ВГС у обезьян парал­лельно подтверждали с помощью тест-систем этих же фирм: "Анти-ВГС-ИФА-подтверждающий тест к 3-м антигенам - core, NS3, NS4 (Новосибирск) и  "ИФА-АНТИ-HCV-СПЕКТР" к 4-м антигенам - core, NS3, NS4, NS5 (Нижний Новгород). Антитела класса Ig M к соr-антигену вируса гепатита С опреде­ляли в основном с помощью "ИФА-АНТИ-HCVc-M" (Нижний Новгород), в ряде случаев использовали "РекомбиБест анти-ВГС Ig M" (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск). Сыворотки обезьян и человека исследовали в разведениях 1:2 и 1:5 согласно прилагающихся инструкций. Титрование позитивных сывороток проводили выбороч­но. Результаты ИФА учитывали на спектрофотометре "Uniskan" фирмы "Flow" с использованием фильтра с длиной волны 492 нм.

Индикацию  РНК ВГС в положительных на анти-ВГС сыворотках крови обезьян и человека осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью отечественных  коммерческих тест-систем производства  НПО "ДНК-Техноло­гия" (Москва) и "АмплиСенс HCV-240 / ВКО-440" производства ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ (Москва)  в соответствии с прилагающимися инструкциями. В качестве мишени амплификации использовали консервативный участок в 5' - нетранслируемой области вирусного генома.

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты серологического скрининга обезьян показали (табл.1), что  анти-ВГС были обнаружены у животных практически  всех обследованных видов, однако частота их выявления варьировала от 2,9  до 16,0 %. У макак резусов и яванских (наиболее представленные по численности виды) количество позитивных животных составило 12,1 % и 8,3 % соответственно. Число обследованных обезьян других видов было более ограниченным, однако и среди них были выявлены анти-ВГС (+) особи: у макак лапунде­ров и зеленых марты­шек их число было наибольшим (16,0 %), у  павианов гамадрилов и анубисов - наименьшим (менее 6 %). Общий про­цент инфицированности обезьян ВГС составил 10,5%, что значительно превышает таковой у здорового населения [ 2 ]. Пред­став­­лен­ные в табл. 1 данные о наличии серопозитивных обезьян являются суммарными. Они получе­ны на основании подтверждения результатов анализа в одной из двух или параллельно в двух использованных тест-системах ИФА.  Следует отметить, что при парал­лельном подтверждении результатов в двух тест-системах, их полное совпа­дение наблюдалось примерно  в 70 %. Данный факт требует объяснения, и одно из них - использова­ние в  тест-системах антигенов различного белкового состава [ 1 ]. Число ложноположительных результатов, не подтвержденных ни в одной из тест-систем, составило 25 из 1398 (1,8 %).

Как видно из табл.1, спектр антител к ВГС у обезьян отличался большим разнообразием вариантов: от выработки комплекса антител к основным диагнос­ти­ческим белкам ВГС (структурному core и 1-3 неструктурным - NS3, NS4 и NS5), который наблюдался в  23,3-76,9 % позитивных сывороток -  до наличия антител лишь к одному core  антигену  (1,1 - 50,0 %), либо  только к NS белкам (23,1 - 100 %) в зависимости от вида обезьян. Наибольшее количество животных, сыворотки которых были реактивны в отношении как core, так и 1-3 NS белков, было отмечено среди зеленых мартышек, макак яванских и лапундеров  (76,9; 46,4 и  40,0 % соот­вет­­ственно). Среди макак резусов и павианов гамадрилов, наоборот, наибольшее число обезьян (75,6 - 100 %) имели антитела только к NS белкам. При исследова­нии серопози­тив­ных сыворо­ток от челове­ка, спектр антител к ВГС был представлен в основном комплексом антител к core и NS белкам (96,4 %). Следует отметить, что титры анти-ВГС в сыворотках большинства обезьян по сравнению с человеком были невысокими (1:5-1:40).

Таблица 1. Характеристика спектра антител к вирусу гепатита С в сыворотках обезьян различных видов  в сравнительном аспекте с человеком.

Вид

Число

Число

Антитела к белкам ВГС

обезьян

обследо-ванных

позитивных

(%)

core

и

NS

core

NS

макаки

резусы

744

90

(12,1)

21*

(23,3)

1

(1,1)

68

(75,6)

макаки

яванские

338

28

(8,3)

13

(46,4)

5

(17,9)

10

(35,7)

макаки лапундеры

63

10

(15,9)

4

(40)

1

(10)

5

(50)

зеленые

мартышки

81

13

(16,0)

8

(76,9)

0

(0)

3

(23,1)

павианы гамадрилы

138

4

(2,9)

0

(0)

0

(0)

4

(100)

павианы анубисы

34

2

(5,9)

0

(0)

1

(50)

1

(50)

ИТОГО:

1398

147

(10,5)

48

(32,7)

8

(5,4)

91

(61,9)

человек

26

25

(96,2)

1

(3,8)

0

(0)

Примечание: * - число сывороток с антителами (% от общего числа позитивных

сывороток 

Процент серопозитивных обезьян  варьировал  не только от их вида, но и от места содержания. Анти-ВГС (+) животные были обнаружены лишь в 13 из 26 (50 %) обследованных групп макак яванских, в 27 из 34 групп (79,4 %) макак резусов и в 8 из 11 групп (72,7%) зеленых мартышек. Процент серопозитив­ных животных в таких группах варьировал от 5,9 до 35,5 % у макак резусов и яванских, от 23,5 до 44,5 %  - у зеленых мартышек.

Среди анти-ВГС (+) животных были особи различных возрастных групп: от 11 месяцев до 23 лет. Так, среди серопозитивных макак яванских подростки (1-3 года) составили 36 %, молодые особи (от 3-х до 5 лет) - 21 % и половозрелые обезьяны (> 5 лет) - 43 %. Среди зеленых мартышек этот процент  равнялся 7%, 33 % и 60 % соответственно.

Представлялось чрезвычайно  важным исследование сывороток обезьян на наличие анти-ВГС класса М, что могло бы служить доказательством "свежей" инфекции. Всего с этой целью было обследовано 401 обезьяна, 34 (8,5 %) из которых содержали Ig  М.   Общее количе­ство обезьян, содержащих Ig М антитела из числа  Ig G положительных к данному вирусу  составило 17,5 %.(18 из 103), а из числа Ig G отрицательных - 5,4 % (16 из 298). Частота обнаружения Ig М в сыворот­ках обследованных обезьян варьировала в зависимости от вида обезьян и  была наибольшей у макак резусов и лапундеров (9,6 % и 7,9 соответственно).  Следует отметить, что титр анти-ВГС класса М был  невысоким (1:5 - 1:20).

Нами также были начаты исследования, направленные на обнаружение РНК ВГС в сыворотках анти-ВГС позитивных обезьян  с помощью ПЦР. Это чрезвы­чайно важный тест позволяет свидетельствовать о наличии генетического материала вируса в сыворотках и о его активной репликации  в орга­низ­ме обезьян.  Всего с этой целью уже проверено около 80 серопозитив­ных и 6 серонегативных сыворо­ток обезьян. По предварительным данным, подтвержденным в 2-х тест-системах отечест­­вен­но­го призводства, РНК ВГС была обнаружена в 11 из 78 (14,1 %) анти-ВГС (+) сывороток обезьян: от 8 макак резусов,  2 макак яванских и одного макака лапундера. Как видно из табл. 2., сыворотки РНК (+) обезьян характеризо­ва­­лись различным спектром анти-ВГС: 8 из 11 (72,7 %) имели антитела к  комплек­су core и 1-3 NS антигенам,  1 (9,1 %) - только к core антигену и 2 (18,2 %) - к NS антигенам. Следует отметить, что  антитела класса М были обнаружены в 4 из 11 (36,4 %) РНК ВГС позитивных сыворотках обезьян. Возраст РНК (+) обезьян варьировал от 1,6 до 22,4 лет. Необходимо также подчеркнуть, что РНК была обнаружена не менее, чем у двух обезьян, находящихся в  вольерах №№ 23, 67 и 11, количество серопози­тивных особей в которых составляло 23-28 %. Животные этих групп представляют чрезвычайно важный интерес в эпизоотоло­ги­ческом и эпиде­мио­ло­гическом плане и нуждаются в динами­че­ском наблюдении.

Прeдставляют значительный интерес исследования, направленные на поиск возможного источника инфек­ции ВГС для обезьян, а также на выявление эпиде­миоло­гической опас­ности позитивных животных для человека. Предварительные данные, получен­ные при серологическом обследовании около 80 % обслуживаю­щего персонала питомника и сотрудников лабораторий, показали отсутствие у них   маркеров гепатита С.

Таким образом, нами впервые получены серологические и вирусологические данные, свидетельствующие об естественном инфицировании  низших обезьян Старого Света вирусом гепатита С (при использования диагностических тест-систем для определения мркеров ВГС у человека). Вместе с тем, эти результаты требуют тщательного анализа и дополнитель­ного серьез­ного изучения. Прежде всего, необходимо  решить кардинальный вопрос: связан ли выявленный нами иммуно­ло­­ги­ческий ответ у обезьян непосредственно с ВГС человека, либо с антигенно  родствен­ным, но генетически отличным от него штаммом от обезьян. Поскольку даже штаммы ВГС человека обладают исключительной геномной гетероген­ностью [ 2 ], выделенные нами образцы РНК ВГС от  макак резусов, яванских и лапундеров  нуждаются в дальней­шем генотипировании или секвени­ровании.

Таблица 2. Характеристика РНК ВГС позитивных сывороток обезьян и человека.

 

Характеристика

обезьян

Маркеры вируса гепатита С

Вид обезьян

№№ обезьян

Воз-раст

(годы)

Место

нахож-

дения

анти-ВГС

анти- core

анти-

NS3

анти-

NS4

анти-

NS5

анти-ВГС core IgM

РНК

ВГС

макаки

26102

9,1

вольера 31

+++*

++++

+

+++

+++

++

++++

резусы

33291

1,6

клетка 5

++++

+

++

++++

+

++

++

3101

12,8

вольера 23

++++

+

++++

+

-

+

++

32273

3,8

вольера 23

++++

++

++

++++

+

-

++++

32740

2,4

1-й участок

+++

+++

++++

++++

-

-

++

32967

6,0

вольера 67

++

+

+++

+

+

-

++++

33406

1,6

вольера 67

+++

-

++

++++

-

-

++++

21945

14,1

вольера 25

+++

-

++++

+

+

-

++

макаки

30598

8.5

вольера 11

++++

++++

++

-

-

+

++

яванские

31030

8.2

вольера 11

++

++

+

-

-

-

++

макаки

лапундеры

17184

22,4

вольера 54

++++

++++

-

-

-

-

++++

Человек

Больной 1

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

Больной 2

++++

++++

++++

++++

++++

++++

++++

Примечание: * - степень интенсивности реакции.

Необходимо было также проанализировать наличие  большого разнообразия анти­тель­­­­ного ответа к ВГС у обезьян и его меньшую  выраженность по сравнению с человеком, а также имеющийся факт выявления  анти-ВГС только к NS белкам вируса у довольно большого числа обезьян. Следует отметить, что похожие данные были получены при серологическом обследовании шимпанзе спустя 2,5-10 лет после их экспериментального заражения штаммами ВГС от человека [5]. Мониторинг необхо­ди­мо продол­жить с целью дальнейшего изучения особенностей формиро­вания гумо­раль­ного иммуни­тета к ВГС у обезьян в динамике, а также с  эпизоото­логической и эпиде­миоло­гической точки зрения. Чрезвычайно важны также поиски биохими­ческих и морфо­логи­ческих признаков гепатита С у обезьян для оценки его клинических форм.

ЛИТЕРАТУРА

1.   Канев А.Н., Шалунова Н.В., Нетесов С.В. и др. // Вопр. вирусол. - 2000. - №4. - С. 42-47.

2.   Львов Д.К. // Журн. микробиол. - 1997. - №1. - С. 70-77.

3.   Abe К., Кurata T., Teramoto Y. et al. // J. Med. Primatol. - 1993. -  Vol. 22. - N 7-8. - P. 433-434.

4.   Claire M.S. // In Lab. Prim. Newsletter. - 1997. -  P. 5-6.

5.   Doorn L.J., Van Belkum A., Maertens G. et al. // J. Med.Virol. - 1992. - Vol.38. - N.4.  -  P. 298-304.

6.   Kalter S.S., Heberling R.L., Cook A.W. et al. // Lab. Anim. Sci. - 1997. - Vol. 47. - N.5. - P.461-467.

7.   Xie Z.C., Riezu-Boj J.I, Lasarte J.J. et al. // Virology. - 1998.-  Vol. 244. -  N2. -  P.513-520.